Micro-análisis cuantitativo de sustancias orgánicas

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Fritz Pregl - Discurso al recibir el Premio Nobel de Química

Hoy, al aceptar el honor de dirigirme a esta ilustre asamblea en esta memorable ocasión, cumplo con el 9 de los Estatutos de la Fundación Nobel, y a la vez, me gustaría aprovechar la oportunidad de expresar mi más humilde agradecimiento a la Academia Suiza de Ciencias por condecorarme con el premio Nobel de Química del año 1923.

Dos años atrás, tuve el honor de entregar dos discursos para expertos en Kemiska Sällskapet (Sociedad Química) sobre el micro-análisis orgánico cuantitativo desarrollado por mi. La naturaleza de mi deber hoy no me permite presentar todos los detalles descritos y demostrados en esa oportunidad, ni tampoco cuento con el tiempo que me permita ejecutar dos experimentos importantes, por lo tanto solo puedo darles una vistazo del origen, desarrollo y de los resultados finales hasta la fecha del micro-análisis cuantitativo orgánico.

Sentí el impulso interno de desarrollar el análisis de sustancias orgánicas con mucho menores cantidades de las que se venían utilizando mientras trabajaba en la investigación de una sustancia, la cual solamente podía obtenerse en cantidades extraordinariamente pequeñas; por lo que me vi forzado a decidir si procesaba toneladas de material o encontraba nuevos métodos con los cuales obtener resultados analíticamente correctos utilizando mucho menores cantidades de sustancia que las utilizadas con anterioridad. Decidí tomar el último camino. El plan más obvio fue aplicar reducciones a todo y en todo, no solamente en la reducción de la sustancia, sino también en la relación con los aparatos, reactivos químicos, etc,. envueltos.

Esto produjo no solo la necesidad de llevar todos los pesos con mucho mayor exactitud de lo que las balanzas permitían, sino que la balanza debía ser construida de tal manera que permitiera acomodar la diversidad de dispositivos con formas alternas que debían ser pesados. La balanza para ensayos de metales preciosos de Wilhelm Kuhlmann en Hamburgo, la cual ya era utilizada en laboratorios, alcanzaba exactitudes de 0.01 a 0.02 mg suficiente para llenar el requisito en un alto nivel. El diseñador, afortunadamente, llevó a cabo grandes mejoras bajo mis sugerencias, por lo que ahora es posible realizar mediciones de peso con una exactitud de ±0.001 mg en un rango de 20 mg utilizando la micro balanza diseñada por él y ahora de uso común.

El asumir que al correr el punto decimal para todos los factores probó que no era el mejor camino para lograr nuestra meta porque seguido a la reducción de la cantidades de la sustancia aparecieron efectos que decisivamente influenciaban el resultado del micro-análisis. Efectos que tenían poco o ninguna influencia en el macro-análisis por lo que no habían sido notados con anterioridad.

Esto es muy simple de ilustrar en relación a la determinación de nitrógeno acorde a Dumas. La determinación volumétrica del nitrógeno que se librea durante este proceso es influenciado en tal extensión por el hidróxido de potasio al 50% adherido al interior del tubo de medición del micro-nitrómetro, este 2% debe ser deducido del volumen registrado. Los requerimientos sobre el dióxido de carbono utilizado para des-aeración y para expeler el nitrógeno debían ser mucho más exactos a los que habíamos estado acostumbrados por lo que fue necesario encontrar una fuente de dióxido de carbono completamente libre de aire. Hasta este momento no había falta de trabajo en esa dirección y es peculiar que casi siempre la masiva cantidad de mármol compacto fuera sospechoso de ser el portador del aire; por lo que fue aun necesario hervirlo al vacío, y el hecho que se obvió es que las soluciones acuosas como el ácido clorhídrico son capaces de absorber cantidades considerables de aire y nitrógeno. Más aún, se encontró imperativo que el álcali sellando el volumen de nitrógeno liberado no hiciera espuma; se encontró que el tratamiento con hidróxido de bario extraía las sustancias del álcali que producían espuma. Finalmente, se encontró que la posición de la masa del cobre reducido en el tubo era de gran importancia y la posición más correcta probó ser en el medio del tubo, la parte más caliente.

El desarrollo de la determinación de carbón e hidrógeno fue considerablemente más difícil, porque el problema aquí fue primeramente que los productos de combustión resultantes a absorber estuvieran libres de mezclas foráneas y segundo, que el incremento de peso debería estar relacionado únicamente al agua y dióxido de carbono producidos. Por ejemplo, aún cuando se usen aire limpio y oxígeno puro se puede obtener un incremento incorrecto del peso, si los gases son conducidos a través de tubos de hule, porque estos liberan cantidades notables de vapores conteniendo carbón e hidrógeno en el flujo de gas. El envejecimiento artificial, por ejemplo, pasando vapor por los tubos durante una hora puede eliminar esta propiedad indeseable.

Si la sustancia a ser analizada contiene nitrógeno, halógenos, o azufre, podrían producirse gases durante la combustión, los cuales podrían ser registrados (pesados) erróneamente y reportados como dióxido de carbono, porque estos gases también son retenidos por el agente absorbente (ej. "soda lime"). En tal caso, por supuesto, el ingreso de tales gases al aparto debe ser prevenido a cualquier costo. Como en el macro-análisis, diferentes tubos trampa son recomendados para varias sustancias dependiendo de su composición, mi principal meta fue desarrollar un tubo trampa que siempre pudiera retener todo con excepción del dióxido de carbono y el agua. Por esto lo llamé el tubo trampa universal. Consiste de una mezcla de óxido de cobre y cromato de plomo entre dos capas de plata con una capa final de peróxido de plomo en asbestos calentados a 180ºC.

Desde la invención del aparato de potasio de Liebig's y del tubo de cloruro de calcio muchas variaciones han sido realizadas en el curso de cerca de un siglo del aparato usual para análisis elemental. Escogí para este propósito la forma más simple, un tubo. Es muy obvio que las más pequeñas impurezas causen errores especiales. El entibiamiento causado por fricción, origina que estos pequeños dispositivos aparenten ser más livianos en peso, luego, cuando no han sido llenados, presentan un peso constante después de 10 - 15 minutos. Sin embargo, si contienen un agente absorbente y si sus conexiones abiertas en ambos extremos no son tapadas, podrán incrementar en peso a la misma razón aun después de que este periodo haya pasado, en otras palabras, absorbe el vapor de agua del aire por lo que aumenta de peso. Finalmente tuvimos éxito en prevenir completamente esta difusión del vapor de agua al utilizar tapones capilares entre las expansiones grandes y pequeñas de la línea de flujo; este arreglo presenta un gradiente de difusión gradual tal que aún el instrumento de pesado más sensitivo para micro-análisis no notará el incremento de peso durante los periodos bajo consideraciones prácticas.

Por otro lado, el uso de estos tapones capilares presentan una resistencia considerable al flujo de gas resultando en un incremento de la presión en el interior del tubo de combustión. Esto provocó nuevas dificultades, las conexiones de los tubos entre los aparatos, particularmente entre la salida tibia del tubo de combustión y el tubo de cloruro de calcio -el punto más crítico- podría causar la pérdida de productos de combustión consecuencia del incremento de presión y si la conexión del tubo estuviera ligeramente dañada, y especialmente por el hecho de que el hule tiene la peculiaridad de permitir fácilmente la difusión del dióxido de carbono. Eliminé este tipo de riesgos al ecualizar la presión en el lugar crítico con la del exterior, ej. la presión atmosférica. Este efecto puede conseguirse fácilmente por medio de un balón de Mariotte.

Cuando todas estás condiciones han sido observadas, es muy fácil obtener resultados analíticos exactos para 2 a 4 mg de sustancia. La cantidad más pequeña utilizada fue 1 mg y la divergencia estuvo aún dentro del margen de error permisible. De esta manera hemos reducido excepcionalmente la cantidad de sustancia requerida para el análisis. Hay que tener en cuenta que Liebig usó 0.5 g de sustancia y originalmente 1 g y que hacia al final del siglo pasado 0.15 a 0.2 g era usualmente considerada la cantidad requerida, podemos decir con propiedad que el micro-análisis ha reducido las cantidades de sustancia requeridas para la determinación en cien veces de lo que era necesario 10 años atrás. Esta reducción no perjudica la exactitud en ninguna manera y me atrevo a decir que mis estudiantes demandan mayor exactitud del micro-análisis que los esperados del macro-análisis. Esto probablemente por el hecho de que las condiciones básicas son mucho mejores y pueden ser cumplidas completamente de lo que era posible con el macro-análisis. Existen dos ventajas adicionales que se deben tener en mente. Primeramente, el gran ahorro en gases y reactivos, segundo y más valioso, el ahorro en tiempo. De tal manera, es posible obtener el mismo resultado en menos de una tercera parte del tiempo requerido en el macro-análisis; la decisión de repetir un micro-análisis es mucho más fácil de tomar porque el trabajo es mucho más corto y placentero.

En la determinación general de halógenos y sulfuro se usaba originalmente el método de Carius. Los precipitados obtenidos generalmente quedaban atrapados en los pequeños crisoles Gooch, me gustaría mencionar que yo fui el primero en reconocer que la presencia de cloruro de bario era esencial para la descomposición de las sustancias conteniendo sulfuro con ácido nítrico; sin este, es segura la pérdida. Al final, un proceso analítico completamente nuevo fue descubierto para descomposición de sustancias orgánicas el cual consiste en quemar la sustancia en una corriente de oxígeno puro y luego hacer pasar los productos de combustión sobre platino al rojo vivo para completar la descomposición. Para las determinaciones de halógenos, estos productos de combustión son recolectados en una solución de sulfito alcalino, para los productos de determinaciones de sulfuro se recolecta en perhidrol, en las que están remojadas las perlitas de porcelana. Todo esto es realizado en un tubo de vidrio endurecido pudiendo ser utilizado cientos de veces para el mismo propósito. Todo el halógeno es obtenido con el líquido de enjuague en la forma de haluro de sodio, todo el sulfuro en forma de ácido sulfúrico. Aquí, también hubieron dificultades con la determinación del halógeno, porque los valores obtenidos después de la acidificación del sulfito alcalino con ácido nítrico era muy alta. La explicación era que la oxidación de sulfito a ácido sulfúrico no procedía directamente, sino por la precipitación del azufre elemental, el cual podría indicar que esta reacción no procedía mono-molecularmente, sino probablemente por la vía de un ácido "polythionic". Por esta razón, si primeramente usamos perhidrol como agente oxidante en un solución alcalina y luego acidificamos con ácido nítrico el sulfuro no es precipitado y los resultados son obtenidos en forma correcta. Los haluros de plata resultantes son atrapados en un tubo filtro y pesados después de secado. Instrucciones analíticas similares resultaron con las determinaciones de sulfuro; si estas instrucciones son seguidas al pie de la letra, la integridad de los datos está asegurada.

Mi asistente, Dr. Hans Lieb ha desarrollado métodos para la determinación de fósforo y arsénico en sustancias orgánicas, de los cuales los resultados obtenidos son satisfactorios. Fuera de la determinación cuantitativa de los elementos que conforman la estructura de una sustancia orgánica, el contenido cuantitativo de cierto grupo de átomos es de extrema importancia. Por ello desarrollé la determinación del grupo carboxilo por acidimetría al usar fenolftaleina como indicador; más aún desarrolle la determinación de grupos "methoxy" y "methylimide". No quiero ir en detalles, pero es incalculable la enorme simplificación del micro-aparato cuando se compara con el macro-procedimiento en conexión con la determinación de methoxy, el pesado de la sustancia en cápsula de estaño es un nuevo principio de gran ventaja, debido a que el ácido yodídrico no choca por su contenido de yoduro de estaño. Para la determinación de "methylimide", el hecho de que la razón de ácido yodídrico (HI) con cantidad de sustancia usada (aprox. 3 mg) debería ser más favorable que para el macro-proceso analítico, un hecho no tomado en cuenta. Esto fue notado por primera vez en conexión con "physostigmine", solamente a través de métodos micro-analíticos fue detectado un tercer metil o un grupo etil, donde previamente solo dos habían sido asumidos, por esta razón la estructura de este cuerpo debe ser revisada.

La determinación del peso molecular por el método de punto de ebullición ha sido también práctico a través del micro-análisis, ya que podemos obtener resultados confiables con tan solo 7 mg.

Es difícil de creer que la más simple de todas las determinaciones, ej. la determinación del residuo a través de ácido sulfúrico fumante, necesaria para la determinación de Na, K, ca, etc. en sustancias orgánicas, solo pueda ser adaptada de tal forma que no demande de grandes habilidades del analista y aún así dar resultados satisfactorios que los principiantes siempre piensan que ellos son mero accidente, mucho después de que métodos difíciles como los anteriormente descritos hubieran sido desarrollados.

Finalmente, no sería superfluo cuestionarse qué resultados positivos conseguiremos con el micro-análisis en adelante.

En este sentido podremos mencionar que uno de los primeros resultados fue el descubrimiento de que el color amarillento de la materia corpórea lutea de los ovarios de las vacas era caroteno, hallazgo realizado gracias al micro-análisis del carbón e hidrógeno. La sustancia la cual se encuentra en zanahorias es ampliamente encontrada en el reino vegetal. Esta sustancia fue extraída de aproximadamente 10,000 ovarios en el Willstätter Laboratory en Zurich y hubiera sido suficiente solamente para un macro-análisis. En este caso el micro-análisis a hecho posible un importante progreso a nuestro conocimiento, al probar que la misma sustancia aparece como materia coloreada en ambos reinos, tanto el vegetal como el animal.

También, en vista de la pequeña cantidad de material disponible, quiero guiar su atención a la valiosa información en estructura molecular obtenida por medio del micro-análisis, a través del trabajo de Adolf Windaus en "cymarin" y colesterol, y del trabajo de Wieland en la descomposición del ácido biliar, donde el micro-análisis probó su valor.

Por último pero no menos importante quiero mencionar que muy recientemente Swede, C.A. Yllner aplicó métodos micro-analíticos exitosamente en mi Instituto en Graz para la identificación de alcaloides en casos forenses, esto es, cuando estos deben ser extraídos de cuerpos diseccionados. En los últimos años mis métodos también han sido aplicados en tecnologías para el análisis electrolítico de metales; y para el análisis de vinos han sido desarrollados métodos muy ingeniosos, aparte de los discutidos aquí.

Estoy muy esperanzado que en el futuro el micro-análisis orgánico cuantitativo pueda encontrar mucho más campos de aplicación y expansión, y que esto haga posible mayor perspicacia y discernimiento que de otro modo no hubieran sido posibles, especialmente para se consecuente con el magnificente reconocimiento que ha hecho la "Swedish Academy of Sciences"
From Nobel Lectures, Chemistry 1922-1941